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DAP-seq實驗用到的蛋白表達系統(tǒng)是promega公司的TNTSP6 Wheat Germ Master Mix表達系統(tǒng)（promega  L326A），一種體外真核蛋白表達系統(tǒng)。體外表達用到的載體為promega公司的pFN19K HaloTag? T7 SP6 Flexi? Vector（promegaG184A）。本篇為大家介紹一套超高性價比的載體構(gòu)建方案：

Part

1

線性化載體

此步驟是通過PCR擴增來線性化載體，PCR后需要切膠回收降低假陽性。

 P-T7sp6-R（線性化反向引物）：cgcgttatcgctctgaaagtac

 P-T7sp6-F（線性化正向引物）：aaacgaattcgggctcggtac

配置反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件：

電泳切膠回收，片段大小4000左右。

Part

2

基因克隆

正向引物設(shè)計：ttCAGAGCGATAACGCG+ 基因ATG開始上游引物

反向引物設(shè)計：cgAGCCCGAATTCGTTT+基因下游引物TAA結(jié)束（反向互補）

配置反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件：

電泳切膠回收片段。

Part

3

連接轉(zhuǎn)化

重組反應(yīng)配制反應(yīng)體系如下： 

反應(yīng)溫度為 50℃ 5min。

將克隆用的化學(xué)感受態(tài)細胞置于冰上解凍。

取 5 - 10 μL 連接產(chǎn)物加入到 100 μL 感受態(tài)細胞中，輕彈管壁混勻 ( 請勿振蕩混勻 )，冰上靜置 30 min。注意：連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化體積最多不應(yīng)超過所用感受態(tài)細胞體積的 1/10。 

42℃水浴熱激 60 sec 后，立即置于冰上冷卻2 min。

加入900 μL SOC 或 LB 液體培養(yǎng)基 ( 不添加抗生素 )，37℃搖菌 1 h ( 轉(zhuǎn)速 200 rpm)。

10000 rpm 離心 1min，棄掉900 μL 上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的平板上輕輕涂勻。

37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 12 - 16 h。

陽性克隆測序鑒定，提取質(zhì)粒。

Part

4

附錄

1 測序引物pT7SP6-cx-F：tgcaaggctgtggacatcgg

2  pFN19K模板索取登記電話：13826269811

3 原始載體序列信息

Ggatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggtacgatttaggtgacactatagaataaggagaattcatcatggcagaaatcggtactggctttccattcgacccccattatgtggaagtcctgggcgagcgcatgcactacgtcgatgttggtccgcgcgatggcacccctgtgctgttcctgcacggtaacccgacctcctcctacgtgtggcgcaacatcatcccgcatgttgcaccgacccatcgctgcattgctccagacctgatcggtatgggcaaatccgacaaaccagacctgggttatttcttcgacgaccacgtccgcttcatggatgccttcatcgaagccctgggtctggaagaggtcgtcctggtcattcacgactggggctccgctctgggtttccactgggccaagcgcaatccagagcgcgtcaaaggtattgcatttatggagttcatccgccctatcccgacctgggacgaatggccagaatttgcccgcgagaccttccaggccttccgcaccaccgacgtcggccgcaagctgatcatcgatcagaacgtttttatcgagggtacgctgccgatgggtgtcgtccgcccgctgactgaagtcgagatggaccattaccgcgagccgttcctgaatcctgttgaccgcgagccactgtggcgcttcccaaacgagctgccaatcgccggtgagccagcgaacatcgtcgcgctggtcgaagaatacatggactggctgcaccagtcccctgtcccgaagctgctgttctggggcaccccaggcgttctgatcccaccggccgaagccgctcgcctggccaaaagcctgcctaactgcaaggctgtggacatcggcccgggtctgaatctgctgcaagaagacaacccggacctgatcggcagcgagatcgcgcgctggctgtcgacgctcgagatttccggcgagccaaccactgaggatctgtactttcagagcgataacgcg（載體擴增R引物位置） atcgccatggaataagtaaggaatccacatggcacaggttatcaacacgtttgacggggttgcggattatcttcagacatatcataagctacctgataattacattacaaaatcagaagcacaagccctcggctgggtggcatcaaaagggaaccttgcagacgtcgctccggggaaaagcatcggcggagacatcttctcaaacagggaaggcaaactcccgggcaaaagcggacgaacatggcgtgaagcggatattaactatacatcaggcttcagaaattcagaccggattctttactcaagcgactggctgatttacaaaacaacggaccattatcagacctttacaaaaatcagataatgttt（載體擴增F引物位置）aaacgaattcgggctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagctgatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggttcgcttgctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccggggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttgcgccctgagtgcttgcggcagcgtgagcttcaaaagaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgacggtcgtttcgcatgcttgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgcactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgtatgccggatggtgaggatctcgtcgtgactcatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaaccggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatttcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttatagtccggaaatacaggaacgcacgctggatggcccttcgctgggatggtgaaaccatgaaaaatggcagcttcagtggattaagtgggggtaatgtggcctgtaccctctggttgcataggtattcatacggttaaaatttatcaggcgcgattgcggcagtttttcgggtggtttgttgccatttttacctgtctgctgccgtgatcgcgctgaacgcgttttagcggtgcgtacaattaagggattatggtaaatccacttactgtctgccctcgtagccatcgagataaaccgcagtactccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatcttttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcat